AP 2: Entstehung von InsP und Wirkung auf die Zusammensetzung und Eigenschaften der mikrobiellen Gemeinschaft im Verdauungstrakt des Huhns
In diesem Arbeitspaket werden Einflüsse von Zulagen von Phosphat oder Phytase auf die Entstehung von InsP und die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Verdauungstrakt untersucht. Hierbei liegen die Schwerpunkte sowohl bei Phytase bildenden als auch bei ausgewählten pathogenen und potentiell pathogenen Bakterien sowie den Virulenz- und Adaptationseigenschaften und den Resistenzmustern ausgewählter Bakterien.
1. Tierexperimenteller Ansatz
Es wird mit Basaldiäten gearbeitet, die einen hohen Gehalt an InsP6, einen marginalen Gehalt an verwertbarem P, und keine native Phytase enthält. Die experimentellen Behandlungen beinhalten eine Variation in der Zulage von anorganischem Phosphat, Calcium und mikrobieller Phytase. Die Untersuchungen werden mit Masthühnern (Broilern) durchgeführt. Nach definierter Fütterung mit den experimentellen Diäten wird der Inhalt (Chymus) des Verdauungstraktes aus verschiedenen Abschnitten (Kropf, Magen, Dünndarm, Blinddärme) entnommen und Teilproben werden für die nachfolgenden Arbeitsschritte spezifisch aufbereitet.
2. Abbau von InsP6, Entstehung niederer InsP, und P-Verwertung
In den Proben des Verdauungstraktes werden die InsP mittels Hochdruckionenchromatographie und die Gehalte an P bestimmt. Über den Einsatz von Titanoxid als unverdaulichen Marker können die P-Verwertung und der Abbau von InsP6 quantifiziert werden. Bisherige Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede in Abhängigkeit von der Zulage von mineralischem Phosphat und Phytase (Zeller et al. 2015).
3. Mikrobielle Gemeinschaft
Um zu untersuchen, welchen Einfluss unterschiedliche InsP-Konzentrationen auf die Darm-Mikrobiota haben, wurden aus den Chymusproben des Verdauungstraktes (Kropf, Dünndarm, Blinddarm) DNA und RNA isoliert und high throughput-Sequenzierungen mit anschließenden Datenbank-Vergleichen durchgeführt. Die Sequenzierung von 16S rRNA-Genen auf Basis der isolierten DNA lieferte Informationen zur Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft unter den verschiedenen Fütterungsbedingungen (Witzig et al. 2015). Die RNA-basierte Sequenzierung ermöglichte ergänzend dazu eine Metatranskriptom-Analyse. Basierend auf diesen Ergebnissen sollen im Anschluss einige der detektierten Phytase-bildenden Mikroorganismen-Spezies sowie die Expression der nachgewiesenen Phytasen mittels RT-qPCR quantifiziert werden, um deren Bedeutung für den Abbau der InsP bei variierender Versorgung der Tiere mit anorganischem Phosphat bzw. bei Einsatz exogener Phytasen besser abschätzen zu können.
4. Einfluss der Verfügbarkeit verschiedener InsP auf pathogene bzw. potentiell pathogene Bakterien
Aus denselben Chymusproben, die für die DNA- und RNA-Extraktion Verwendung finden, werden mittels Standard-Kultur-Methoden und PCR qualitativ und quantitativ Salmonella spp., Campylobacter spp. und ESBL (extended spectrum ß-lactamase) bestimmt. Insbesondere die Differenzierung und Charakterisierung der gewonnenen Bakterienisolate erfolgt mittels PCR-Techniken. Die Salmonella-, Campylobacter- und ESBL-Isolate werden anschließend in in vitro-Infektionssystemen (eukaryotische Zellkultursysteme, Amöben) hinsichtlich ihrer Virulenzeigenschaften und metabolischer Eigenschaften charakterisiert. Die dabei verwendeten Methoden sind:
· pangenomische Studien: DNA-, RNA-Sequenzierung
· Expressionsprofile, in vitro Wirt-Pathogen-Interaktionsassays.
Außerdem sollen in vivo-Studien am Darmepithel (Histologie, Immunhistochemie) Aufschluss über die lokalen Interaktionen der Bakterien mit dem Wirt geben.
Teilprojektleiter
Mitarbeiter
Dr. Karen Hills
Dr. Maren Witzig
Dr. Amélia Camarinha Silva
Dr. Ellen Zeller
MSc Vera Sommerfeld