1. Tierexperimenteller Ansatz

Es wird ein 2×2-faktorieller Versuchsansatz gewählt, der durch eine unterschiedliche Versorgung mit anorganischem Phosphat (P) und die Verwendung unterschiedlicher Proteinquellen in den Versuchsrationen gekennzeichnet ist. Es werden semi-synthetische Rationen eingesetzt, deren Nährstoffgehalte mit Ausnahme von P bedarfsgerecht formuliert werden, um die Auswirkungen einer variablen P-Versorgung bewerten zu können. Die Auswahl der Supplementierungsstufen an P erfolgt in Anlehnung an die tierexperimentellen Untersuchungen am Broiler in AP2. Zur Gewährleistung einer ausreichenden Fermentationsaktivität bis in die distalen Abschnitte des Gastrointestinaltraktes enthalten die Versuchsdiäten ein Gemisch aus Carboxymethylcellulose und Kartoffelstärke. Darüber hinaus erfolgt eine Modulation der Fermentationseigenschaften durch Zulagen unterschiedlicher Proteinquellen, indem hochverdauliches Soja-Protein im Vergleich zu schwerer verdaulichem Erbsen-Protein eingesetzt wird. Dies wiederum lässt Differenzierungen im Abbau von InsP und damit einhergehend in der Zusammensetzung und metabolischen Aktivität der intestinalen Mikrobiota erwarten, weil unter anderem davon ausgegangen werden kann, dass unterschiedliche Proteine eine unterschiedliche Bindungsspezifität für InsP₆ aufweisen.

Es werden in einer 2×2-faktoriellen Anordnung der Behandlungen insgesamt 4 Versuchsrationen eingesetzt:

1. Erbsen-Protein + marginale Phosphorversorgung
2. Erbsen-Protein + P-Zulage
3. Soja-Protein + marginale P-Versorgung
4. Soja-Protein + P-Zulage

Die Untersuchungen umfassen zwei Versuchsreihen mit jeweils 15 bzw. 16 Tieren. Während der Adaptationszeit von drei Wochen an die jeweiligen Rationen und im darauffolgenden Versuchszeitraum von fünf Wochen erfolgt die regelmäßige rektale Entnahme von Faeces zur Differenzierung der mikrobiellen Zusammensetzung und mikrobiellen Aktivität im Zeitverlauf. Zudem wird nach Ende der Adaptationszeit eine Immunisierung mit dem Neoantigen KLH (keyhole limpet hemocyanin) durchgeführt (zweifache Impfung im Abstand von 2 Wochen), um die Funktionalität des Immunsystems in vivo zu testen. In wöchentlichen Abständen erfolgt über einen Zeitraum von vier Wochen die Entnahme von Blut zur Ermittlung der KLH-spezifischen Antikörpermenge, sowie der Bestimmung weiterer peripherer Immunparameter. Am Ende des Versuches werden aus definierten Abschnitten des Verdauungstraktes Proben der Digesta und des Gewebes (Milz und mesenterische Lymphknoten) entnommen.

2. Abbau von InsP₆, Entstehung niederer InsP, und P-Verwertung

Entsprechend der Untersuchungen am Broiler (AP2), werden in den Proben des Verdauungstraktes die InsPs mittels Hochdruckionenchromatographie und die Gehalte an P bestimmt, so dass die P-Verwertung und der Abbau von InsP₆ quantifiziert werden können.

3. Mikrobielle Gemeinschaft und ihre metabolische Aktivität

Die aus dem Verdauungstrakt gewonnenen Proben (Faeces, Digesta) werden analog zu den Untersuchungen am Broiler (AP2) hinsichtlich möglicher Veränderungen in der Zusammensetzung und Aktivität der Mikrobiota untersucht. Dazu erfolgt im Einzelnen die Bestimmung von:

• Veränderungen in der bakteriellen Taxonomie (mittels quantitativer real-time PCR) durch Erfassung folgender Gruppen: gesamte Eubakterien, Lactobacilli, Bifidobakterien, Clostridium cluster IV, Clostridium cluster XIVa, Enterobacteriacae, Bacteroides-Prevotella-Porphyro­monas, Roseburia spp., Eubacterium rectale
• Veränderungen in der metabolischen Aktivität der intestinalen Mikrobiota durch Erfassung mikrobieller Metabolite (flüchtige Fettsäuren, Ammoniak)
• Auswirkungen auf die metabolische Aktivität der Butyratbildner (Butyratkinase und Butyryl-CoA CoA-Transferase, mittels real-time PCR bzw. Bestimmung der Genexpression)
• In Analogie zu Punkt 4 des AP2 und in enger Vernetzung mit diesem AP werden auch für die Spezies Schwein Analysen zum Einfluss der Verfügbarkeit verschiedener InsPs auf pathogene bzw. potentiell pathogene Bakterien, i.e. Salmonella spp., Campylobacter spp. und ESBL durchgeführt.

4. Immunsystem

Die aus dem Blut und dem Darmgewebe gewonnenen Proben werden in Bezug auf zentrale Immunparameter untersucht, um Veränderungen in der Funktion und Zusammensetzung des Immunsystems (sowohl von darmassoziierten, als auch von peripheren Komponenten des Immunsystems) aufzuzeigen. Aus den gewonnenen Proben erfolgt die Bestimmung von:

• Anzahl und Funktionalität von Leukozytenformen (u.a. CD4⁺ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, regulatorische T-Zellen, B- und NK-Zellen mittels Durchfluss­zytometrie
• Funktionstests (Lymphozytenproliferation)

Um zudem das Zusammenspiel der verschiedenen Komponenten des Immunsystems in vivo zu testen, werden die Tiere mit KLH immunisiert und es wird die Reaktion auf diese Immunisierung gemessen. Dazu erfolgt die Bestimmung von:

• KLH-spezifischen Antikörpermengen im Plasma, vor, während und nach der zweifachen Immunisierung mit KLH
• Die Antigen-spezifische Reaktion von Blut-Lymphozyten nach Reaktivierung in vitro (Proliferation)

Ergebnisse: Zum gegenwärtigen Zeitpunkt der Auswertung lassen einige vorläufige Datenanalysen vielversprechende Ergebnisse erwarten. Der P-Gehalt hat eine modulierende Wirkung auf die Entstehung der adaptiven Immunantwort, u. a. auf die Zellzusammensetzung und Proliferation von T-Zellen im Blut und im Gewebe. Ebenfalls zeigt der P Gehalt eine modulierende Wirkung auf die intestinale Mikrobiota, so ist beispielsweise der Anteil der kohlenhydratfermentierenden Bakterien (Bifidobacterium spp., Eubacterium rectale, Roseburia spp.), sowie der Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren im Caecum verändert.

Teilprojektleiter

Prof. Dr. Volker Stefanski

Prof. Dr. Dr. Rainer Mosenthin

Mitarbeiter

Dr. Sonja Schmucker

Dr. Eva Weiß

Jun.-Prof. Dr. Jana Seifert

Prof. Dr. Ludwig Hölzle

M.Sc. Charlotte Heyer

M.Sc. Katharina Burbach

M.Sc. Bruno Tilocca